Vorgestellt wird ein neuartiges Einbettverfahren für die korrelative Mikroskopie, das auf einem UV-polymerisierbaren Harz basiert, das die Probe optisch aufklart, sie für beispielsweise Lichtblatt- oder optische Tomographie-Aufnahmen (SLOT) fixiert, anschließend schneidbar ist und dadurch eine anschließende immunhistochemische oder elektronenmikroskopische Analyse derselben Proben erlaubt. Darüber hinaus lässt das Verfahren auch anschließende molekularbiologische Analysen, wie beispielsweise die RNA-Extraktion, zu.

Problemstellung

Korrelative Mikroskopie ermöglicht die Kombination von verschiedenen modernen bildgebenden Verfahren miteinander oder auch die Kombination aus bildgebenden Verfahren mit anschließenden molekularbiologischen und biochemischen Methoden. Diese Kombination ermöglicht es aus einer Probe eine weitaus höhere Informationsdichte zu gewinnen und stellt daher eine vielversprechende neue Methode der biomedizinischen Forschung dar. So lassen sich beispielsweise morphologischen Phänotypen mit molekularen Zusammensetzungen korrelieren oder nanoskopische Detailaufnahmen von zuvor makroskopisch erfassten Arealen aufnehmen.
Gleichzeitig stellt diese korrelative Analytik jedoch sehr hohe Anforderungen an die Probenaufbereitung. Die Analyse vom makro- bis nanoskopischen Bereich oder die Analyse mit verschiedenen Untersuchungsmethoden, wie morphologischen oder molekularbiologischen Techniken mit ein und derselben Probe durchzuführen, ist im besten Falle methodisch sehr anspruchsvoll, kann unter bestimmten Umständen jedoch beinahe unmöglich sein. Beispielsweise stellen morphologische Deformation während der Messung, die insbesondere bei zumeist morphologisch instabilen geklarten Proben auftreten können, wie sie für 3D-Mikroskopie-Verfahren benötigt werden, ein großes Problem dar, da sie leicht zu Bewegungsartefakten führen können. Im Gegenzug verlängert jedoch ein langsameres Abrastern der Probe die entsprechende Messzeit.
Für eine anschließende histologische Analyse bedarf es in der Regel einer Einbettung der Probe in geeignete Einbettmedien. Dies kann zu erheblichen Deformationen führen und die erzielten Bilder teilweise kaum vergleichbar machen. Sollen darüber hinaus an die morphologische Analyse noch molekularbiologische Analysen wie RNA-Extraktion angeschlossen werden, kommen zusätzlich Degradationsprobleme hinzu.

Abb. 1: CRISTAL Workflow. A) CRISTAL-eingebettetes optisch aufgeklartes Bein einer Maus (Quelle: Dr. Ripken, LZH). B) Workflow einer korrelativen Studie. CRISTAL-eingebettete Proben können zunächst mit bspw. SLOT untersucht werden, anschließend können dann interessante Regionen (ROI) angeschnitten und dann sowohl der angeschnittene Block mittels Multiphotonen Mikroskopie (MPM) als auch die Anschnitte mittels histologischer Verfahren und Licht- sowie Elektronenmikroskopie weiter analysiert werden (Quelle: adaptiert nach Kellner et al., 2016, Sci Rep).  

Unsere Lösung

Zur Lösung der oben genannten Problemstellung wurde CRISTAL (Curing Resin-Infiltrated Sample for Transparent Analysis with Light) entwickelt. CRISTAL stellt ein neuartiges Einbettverfahren für biologische Proben dar, das auf der Verwendung eines UV-polymerisierbaren Harzes basiert, das eine Mercaptoester-Verbindung enthält (z.B. Norland Optical Adhesive 68 und 71). Über die Einbettung von biologischen Proben in dieses Einbettmedium erfolgt eine Anpassung des Brechungsindexes nach Polymerisation im Bereich von n = 1,45 bis n = 1,6. Die UV-Polymerisierung fixiert gleichzeitig die Probe, was geklärte Proben insbesondere für ein schnelles Verfahren bei 3D-Bildgebungsverfahren, wie der optische Tomographie (SLOT), der Ultramikroskopie, der Optischen Projektionstomographie (OPT) oder der Lichtblattmikroskopie, stabilisiert. Zusätzlich können eingebettete Proben anschließend geschnitten und für immunhistologische oder elektronenmikroskopische Analysen verwendet werden. Darüber hinaus können fixierte Proben auch nach längerer Lagerung noch einer molekularbiologische Analysen unterzogen werden. So ist nachträglich noch ein molekulares Profiling durch RNA-Extraktion möglich.

Abb. 2: Korrelative Mikroskopie eines akzessorischen Lungenflügels einer Ratte. A) Akzessorischen Lungenflügel einer Ratte fixiert und B) nach CRISTAL Einbettung (Quelle: adaptiert nach Kellner et al., 2016, Sci Rep). Korrelation von einem optischen Schnitt einer SLOT-Aufnahme (C) mit einer Durchlicht-Mikroskopieaufnahme einer anschließenden Histologie derselben Probe (D). Maßstabsbalken: 500 µm (Quelle: adaptiert nach Kellner et al., 2012, J Appl Physiol.). C) Mosaikbild von 2D MPM eines angeschnittenen CRISTAL-eingebetteten akzessorischen Lungenflügels einer Ratte. Maßstabsbalken: 1 mm (Quelle: adaptiert nach Kellner et al., 2016, Sci Rep).

Eine Tochter der